前沿资讯 | 用于质粒构建的自动化高通量平台，赵惠民团队开发最通用的 DNA 组装方法

2022 年 5 月 16 日，伊利诺伊大学厄巴纳 - 香槟分校、长期致力于合成生物学及相关流程自动化工作的赵惠民团队在 Nature Communicati…

2022 年 5 月 16 日，伊利诺伊大学厄巴纳 - 香槟分校、长期致力于合成生物学及相关流程自动化工作的赵惠民团队在 Nature Communications 上发表最新成果，再一次带来了合成生物学相关自动化流程的研究进展。这次，是用于质粒构建的多功能、自动化、高通量的端到端平台 ——“PlasmidMaker”。在研究论文的介绍中，该平台的核心组成部分包括了有 “基于激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）Argonaute 蛋白（Pf Ago）的 “最通用” DNA 组装方法”、“易于操作的质粒设计前端”、“简化的工作流程” 以及 “机器人系统集成的后端”。在测试中，通过该平台，研究人员成功利用 11 个 DNA 片段构建了 101 个质粒，涉及了 6 个不同的物种（细菌、酵母、植物和哺乳动物），大小从 5 到 18 kb 不等。在这些过程中，共使用到了约有 2 × 10^4 次的 PlasmidMaker 平台自动化移液步骤，人工干预程度有限。 “该平台允许以高通量方式无错误地构建含有几乎任何序列的质粒……其极大地扩展合成生物学的潜力。” 在论文中，研究人员这样写道。质粒，是 DNA 重组中最常用的一类工具，也是菌株改造 “DBTL 循环” 的关键组成步骤。近些年来，利用高通量自动化赋能 DBTL 循环、加速合成生物学迭代能力，已经成为当前最具潜力的发展方向，而质粒构建相关的自动化研究，自然也不例外。在过往的研究中，研究人员已经设计出了几种方案流程来自动化构建质粒，这其中便有着基于Type-IIS 限制性内切酶的模块化组装或 Golden Gate，以及基于长重叠同源性的 Gibson 组装。 Gibson 组装构建质粒（来源：NEB）然而这些方法，都是存在有局限性的。前者，基于限制性内切酶的方法，主要面临的是序列内部存有限制性内切酶识别位点，以及短粘性末端（＜6 nt）的限制；而后者，基于同源性的方法，则常常受到长单链 DNA 末端二级结构、重复序列，以及填充间隙时错误拼接等干扰，并不是真正独立于序列、通用的。为此，赵惠民团队设计了一种可设计、通用型的 DNA 组装方法，该方法所基于的关键酶，则是激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）来源的 Argonaute 蛋白（Pf Ago）。这是一种与 CRISPR-Cas 类似的核酸内切酶，能够在单链 DNA 引导下，高温靶向切割线性 DNA 分子，产生粘性末端。基于这一特性，研究人员首先可以在线性 DNA 分子设计中，在序列前后加上与其相邻组装片段共享的、长度为 24 bp 的同源序列，之后通过 Pf Ago 在单链 DNA 组合的引导下，靶向切割，产生出 12 nt 长度的粘性末端（突破以往短粘性末端对大 DNA 组装的限制）。 Pf Ago 切割产生 5-12 nt 的粘性末端（来源：Nature Communications）同时，为了进一步拓展 Pf Ago 对于切割序列设计上的可扩展性，研究人员还引入了 Pf Ago 变体 Pf Ago H745D（Pf Ago*）与 Pf Ago 进行组合使用，该变体对于序列的结合能力不同，主要用于序列 GC 含量更高的情况，以获得更高的切割效率。在利用 Pf Ago 组合分别切割各个线性 DNA 分子并纯化之后，下一步，则是使用高保真 DNA 连接酶在体外组装这些切割后的 DNA 分子，反应完成之后，再将组装产物转化进到大肠杆菌细胞中，进行筛选和测试。而这些流程，包括最开始的质粒和同源序列的设计，几乎都是由自动化工作流程完成的。完整的工作流程分为 “设计 - 构建 - 测试” 3 个部分，一共有着 4 大步骤，具体如下： PlasmidMaker 工作流程（来源：Nature Communications） 1、在 “设计” 部分，用户可以按照自己目标方式排列 DNA 片段来设计质粒，也可以使用前端软件从数据库中搜索常用的质粒作为模板。 2、在 “构建” 部分，根据生成的任务清单，系统将准备用于片段扩增的 PCR 板。之后，由 MomentumTM Workflow Scheduling 软件和 F5 机械臂控制的 Tecan FluentControl 液体处理器将稀释和混合引物、模板、引导用的单链 DNA 和预混液。 3、同样是在 “构建” 部分，在 iBioFAB（伊利诺伊州的合成生物大设施）上，将自动化进行不同质粒的 Pf Ago 切割、纯化、连接以及转化。 4、最后，在 “测试” 部分，通过自动化少量提取构建质粒，之后通过限制性切割和凝胶电泳进行验证。正确的质粒再经由液体处理器重新培养以制备冷冻原液。 PlasmidMaker 细分工作流程示意（来源：Nature Communications）这种标准化和集成的单元操作，将允许同时高通量地进行多个质粒的组装构建，编程软件和机械臂负责执行复杂的实验流程，而研究人员只需监督整个系统的正常运行。此外，在该工作流程中前端及后端所使用的完整自定义代码可在 Zenodo 获取，Record 为 5812313（具体链接也可查看文末参考链接）。参考链接： 1. https://www.nature.com/articles/s41467-022-30355-y 2. https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acssynbio.6b00324 3. https://zenodo.org/record/5812313#.YoN7_9pBy3A

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